多光子显微镜:移动中的小鼠大脑成像

多光子显微镜的进步现在使科学家能够在小鼠看到、反应和行为时跟踪多个神经元的活动。

多光子显微镜:移动中的小鼠大脑成像

图片来源:萨特仪器

几十年来,特定神经回路中的放电模式如何决定动物行为的问题一直是神经科学研究的前沿。

对切​​除的脑切片的初步研究提供了部分答案,表明单个神经元的放电模式可能会在活动期间发生变化。 Bernd Kuhn 的工作似乎可以更好地回答这个问题,因为他试图将动物大脑中的神经放电模式可视化,因为它会执行各种行为或对刺激做出反应。

为了做到这一点,日本冲绳科学技术研究生院的神经影像专家库恩需要扩展多光子显微镜成像方法的功能。

多光子显微镜 于 1990 年代首次开发,从那时起,它已被用于帮助揭示动物模型中神经退行性疾病或大脑发育过程中的细胞变化。

随着技术的改进,它为大脑皮层(大脑的最外层)的功能提供了新的见解,大脑皮层负责一系列基本的和高级的大脑功能。

Kuhn 的目标是帮助神经科学家更好地了解帕金森氏症、阿尔茨海默氏症和其他脑部疾病的小鼠模型出了什么问题。这是一项具有挑战性的任务,需要发展关于大脑如何在小鼠执行一系列动作时整合运动、感觉和认知信息的基础知识。

获得这一层次的洞察力需要观察视觉皮层的一个深层的、以前无法进入的层,该层与大脑的更深层称为丘脑进行交流。当每只小鼠睡觉、醒来或跑步时,进行了一个多小时的观察。

库恩的努力是成功的。这些实验涉及一只老鼠在一个移动的球上奔跑以获得水的奖励。老鼠的头部固定在适当的位置,行为相机观察它的眼睛以衡量警觉性。还获得了详细参数的测量结果,例如老鼠舔胡须的频率。

这些行为与来自两个多小时观察的神经活动相匹配——足够长的时间让老鼠感到疲倦并入睡。库恩和他的同事们在报告中报告了他们的发现。 当代生物学 2020 年 10 月的期刊。1 

库恩强调,实验需要持续那么长时间才能观察到各种行为状态:

“这是我们发现行为和神经元活动之间的联系的开始。如果你有任何神经元疾病,你需要以此作为了解出了什么问题的基础。”

穿透力的视觉

指某东西的用途 多光子显微镜 使科学家能够解决生物显微镜中的一个持久问题——需要向细胞添加荧光标记以帮助聚焦某些结构。在共聚焦显微镜(多光子显微镜出现之前的最先进方法)中,用于激发这些荧光团的可见光可能会对脑组织造成损害。

1990 年代初,康奈尔大学的 Winfried Denk 和已故的 Watt Webb 发现了一种通过用红外光而不是可见光激发荧光团来减轻这种损害的方法。

由于红外光的能量较低,它需要两个光子而不是一个光子来激发荧光团。然而,其能量较低的性质意味着它可以深入大脑而不会对组织造成损害。

这一创新进步使神经科学家能够用荧光蛋白或其他荧光标记物标记特定类型的神经元,通过插入动物头骨的透明窗口照射红外光来照亮埋藏的神经回路。

为了在跟踪行为的同时监测神经回路,库恩利用了他与加利福尼亚州 Novato 科学仪器公司 Sutter Instruments 合作开发了五年的成像平台的强大功能。

这个新平台结合了 Sutter 的可移动物镜显微镜 (MOM)——一种双光子仪器,可以通过在空间中移动物镜,同时利用激光一次聚焦一个小区域来促进空间扫描。

该平台还记录长达三个小时的行为,采用公司专有的 MScan 软件来控制实验并整合数据。

使用 MScan 软件,可以在广泛的组织区域内构建多达 10,000 个神经元的 3D 图片。这种能力帮助伊利诺伊州埃文斯顿西北大学的神经科学家 Daniel Dombeck 和他的团队做出了惊人的发现。

为了查明可能允许老鼠监测自己活动的电路,研究人员将每只老鼠放在显微镜下的滚动球上。老鼠的头部固定在适当的位置,并在其周围投射出一个虚拟现实迷宫。研究人员记录了老鼠在虚拟迷宫中奔跑时的神经活动,以确定正在使用的大脑回路。

该研究显示了一个在老鼠活动时会亮起的电路,并揭示了当动物停止移动时会亮起的附近神经回路。研究小组发现,附近的那些电路粗略地记录了老鼠休息了多长时间。 Dombeck 和他的团队在期刊上报告了他们的发现 神经元 in 2014.2 

这些新发现的回路存在于阿尔茨海默病开始的大脑部分。 Dombeck 建议,因为健康人比早期阿尔茨海默氏症患者更能估计时间,所以观察这些回路可以直接测试疾病的早期阶段。

可视化更深的大脑

研究人员现在开始用三个具有更长波长和更低能量的光子激发埋藏的荧光团,以探索更深的大脑层。

双光子显微镜采用 800-1100 nm 光子,能够穿透 0.5-1.0 毫米进入大脑。康奈尔大学的物理学家 Chris Xu 和他的同事们成功地使用了三个波长为 1700 nm 的光子。这些波长能够穿透多达 1.5 毫米的脑组织而不会发生散射。

这种方法还可以更清晰地聚焦激发光,这意味着可以模糊图像的杂散光更少。

多光子显微镜:移动中的小鼠大脑成像

图片来源:萨特仪器

额外的深度实际上非常重要。 我们能够使用双光子显微镜进入大部分皮质。但可以肯定的是,在某些情况下,您确实无法进入该网络的更深层次。那么你可能需要去三光子。

Jack Waters,艾伦脑科学研究所研究员。

三光子显微镜目前依赖于定制或高度定制的设置。然而,它能够透过头骨看到大约 0.5 毫米的图像进入大脑。徐和神经生物学家约瑟夫·费乔(研究自闭症的研究员)最近利用三光子显微镜对活的成年斑马鱼的大脑进行成像。3 

斑马鱼是大脑发育研究中的热门主题,因为它们的头骨在年轻时是半透明的,随着斑马鱼的年龄增长变得不透明。通过观察它们的头骨可以让研究人员将成年斑马鱼与幼年斑马鱼进行比较。

三光子显微镜也可用于研究大型动物的大脑。沃特斯的同事一直将双光子显微镜瞄准猕猴的视觉皮层,它与人类的视觉皮层有一些相似之处。

然而,这种方法只能渗透到六层皮层中的第二层,而大部分感兴趣的活动发生在第四层和第五层。关于三光子技术,沃特斯说,“我们希望能够通过皮层成像大部分,也许是一路。”

激光器用于 多光子显微镜,荧光标记和传递它们的方法不断进步和发展。这项技术现在可用于可视化大脑多个区域中更大脑容量的神经元和突触。

随着技术的不断改进和行业提供越来越多的交钥匙系统,脑科学中的更多问题将得到解答。

有很多人在做这件事。 只有少数人能做到这一点太令人兴奋了。

Kuhn,日本冲绳科学技术研究生院神经影像学专家

参考

  1. Augustinaite, S., Kuhn, B. 互补钙2+ 感觉激活和抑制的第 6 层皮质丘脑神经元的活动反映了行为状态。 当代生物学 30, 1–16 (2020)。
  2. 嘿,J.G.,Rangarajan。 K.V., Dombeck, D.A.细胞分辨率成像揭示的网格细胞的功能性微观组织。 神经元 84, 1079–1090 (2014)。
  3. 周,D.M.等。完整成年斑马鱼大脑的深度三光子成像。 自然方法 17, 605–608 (2020)。

此信息来源于、审查和改编自 Sutter Instruments 提供的材料。

有关此来源的更多信息,请访问 萨特仪器。

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    萨特仪器。 2021。 多光子显微镜:移动中的小鼠大脑成像. AZoOptics, viewed 27 September 2021, //www.selec-iat.com/Article.aspx?ArticleID=1928.

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