什么影响共聚焦显微镜的价格?

许多因素会影响共聚焦显微镜系统的成本。在选择和购买显微镜时,重要的是要考虑仪器的复杂性及其提供的功能。

共焦、宽场、旋转盘或 TIRF 系统的更复杂配置包括更高的相关成本。潜在买家必须围绕高灵敏度探测器、多种成像模式、多模态和同步多色成像进行无数选择。

本文探讨了这些因素和注意事项,并概述了共聚焦显微镜的基本硬件,并概述了选择显微镜时的一些可用选择。 共聚焦显微镜系统 用于特定应用。

全面了解旋转圆盘共焦系统的功能以及了解具有其他成像方式的系统非常重要;例如,TIRF 和超分辨率。

虽然硬件成本是一个关键考虑因素,但软件选项也会影响共聚焦显微镜的总体成本,包括基本软件包中包含的选项和任何扩展软件选项。在最终选择显微镜之前,还应考虑系统服务和长期维护成本。

下面列出了广泛的硬件、软件和维护选项列表,旨在帮助潜在买家选择最合适的系统,同时平衡性能、功能和总体成本。

Andor 的蜻蜓旋转圆盘系统连接到落射荧光显微镜的示意图。

图1。 Andor 的蜻蜓旋转圆盘系统连接到落射荧光显微镜的示意图。图片来源:安道尔科技有限公司

针孔(旋转盘)

用户可以在单针孔和双针孔选项之间进行选择。 

针孔的作用是丢弃散焦的光。 40 µm 针孔非常适合高倍率(63X 和 100X),而 25 µm 针孔则是较低倍率的更好选择。双针孔显微镜将提供更多的多功能性,但会导致额外的成本。

使用旋转圆盘共聚焦显微镜时,针孔的选择是相关的,因为这种类型的设备具有固定的针孔尺寸。针孔选择不是点扫描共聚焦显微镜的问题。

类器官图像。使用 25 um 针孔的 Dragonfly 旋转圆盘共聚焦系统获取的图像。

图 2。 类器官图像。使用 25 um 针孔的 Dragonfly 旋转圆盘共聚焦系统获取的图像。图片由爱丁堡大学 IGMM MRC 人类遗传学组的 Luke Boulter 博士提供。

额外放大

相机端口前的额外放大有助于根据奈奎斯特标准对像素尺寸高于 6.5 µm 的相机进行采集。虽然较大的像素尺寸会收集更多的光,但在较低的放大倍数下无法容纳奈奎斯特。

通过使用能够切换的固定或电动镜头,可以获得额外的放大倍率。能够在 Nyquist 或严格的 Nyquist 标准下采集是去卷积和超分辨率显微镜的关键要求。

各种显微镜公司提供了多种额外的放大倍率选项,其中许多可以与相机结合使用,以便在奈奎斯特条件下进行采集。

二向色性

二向色镜可以是单带通或多带通,用户可以在单、双、三、四和带通选项之间进行选择。多带通二向色镜可以同时进行多色成像,而带通二向色镜是采用双摄像头采集模式的系统的不错选择。

使用各种二向色镜可提高采集的灵活性,并且可以使用电动或手动二向色镜开关。

Dragonfly 转盘系统总共支持四个二向色镜,可通过电动开关互换。

排放过滤器

用户应选择适当数量的单带通或多带通发射滤波器。

多带通发射滤光片可实现更快的多色成像,但必须使用正确的滤光片和荧光染料,以确保生成的图像不会在通道之间出现渗色。然而,单带通发射滤光片可将渗漏风险降至最低。

选择的发射滤光片数量将直接影响多色成像实验期间可能获得的通道数量。

发射滤波器带通示例。单个或多个带通滤波器可用于获取多色图像。

图 3。 发射滤波器带通示例。单个或多个带通滤波器可用于获取多色图像。图片来源:安道尔科技有限公司

激光单元

用户应该考虑多激光线光源可以容纳多少激光器,以及支持的激光功率和支持的激光波长范围。

激光器

用户应考虑使用的激光器数量,以及这些是单模还是多模光纤。还应考虑激光器的功率。

激光数量及其波长将直接影响实验设计和可获取通道的数量。

能够适应近红外 (NIR) 波长 (>650 nm) 的激光单元提供了特定的实验优势 - 这些激光允许更深入地穿透样品,同时由于其能量较低的性质可用于实时成像实验。

单模光纤为衍射受限点扫描提供了强大的点光源,但单模光纤不适用于更长波长的有效耦合或传输。

Dragonfly 的多模光纤和获得专利的 Borealis™ 照明系统支持 400–800 nm 的激发波长和 425–850 nm 的检测波长。特定应用可能需要更高的激光功率;例如,激光烧蚀或超分辨率 (STORM) 实验。

某些实验要求可能会影响对类型、数量、功率和激光波长的要求。这将反过来影响激光器的选择,直接影响系统的复杂性并最终影响系统的成本。

集成激光引擎。图像显示了 Andor 的集成激光引擎,该引擎支持多达 8 条激光线,并在单个单元中容纳近红外范围激光可见。

图 4。 集成激光引擎。图像显示了 Andor 的集成激光引擎,该引擎支持多达 8 条激光线,并在单个单元中容纳近红外范围激光可见。图片来源:安道尔科技有限公司

探测器

用户应该在光电倍增管 (PMT) 和混合探测器之间进行选择,或者他们可能希望使用基于相机的探测器(sCMOS 和 EMCCD)。 PMT 和 sCMOS 或 EMCCD 检测器技术之间存在主要区别。

点扫描仪通常使用光电倍增管 (PMT) 和混合检测器,而多点共聚焦通常使用基于相机的检测器。

许多参数可用于评估科学探测器的性能。这些包括:

量子效率 (QE) – 表示探测器将光子有效转换为电子的能力。更高的 QE 代表更灵敏的检测器;例如,50% QE 说明一半的光子转换为电子。

暗电流 – 在没有任何信号的情况下测量传感器本身产生的噪声。这表示为电子 (e-)/像素/秒。暗电流值越低越好,并且因为它随着时间的推移而增加,随着曝光时间的延长,它变得越来越重要。暗电流可以通过相机冷却来减少。

读取噪音 - 相机电子设备将电子从模拟信号转换为数字信号,然后放大该数字信号。较低的读取噪声值是可取的,因为这会设置相机的本底噪声并定义其检测感兴趣信号的能力。

冷却 – 可以通过冷却相机传感器来减少暗电流。这种冷却可能是被动的(例如,从相机机身到环境空气的热交换),或者可以使用风扇对相机进行空气冷却(尽管这可能会作为振动源)。某些相机型号提供水冷,并且仍然是最有效的冷却选项,特别是对于需要高倍率下高帧率或定位显微镜的振动敏感测量。有效的冷却还降低了可能影响图像质量的“热”或高噪声像素的风险,尤其是在图像堆栈或 3D 体积中。

iXon Ultra 888 EMCCD 和 Sona 4.2B-6 sCMOS 的图像。

图 5。 iXon Ultra 888 EMCCD 和 Sona 4.2B-6 sCMOS 的图像。图片来源:安道尔科技有限公司

基于相机的探测器比 PMT 和混合探测器更灵敏,更擅长捕获光子。

PMT 和混合探测器的 QE 最大为 45%,而 sCMOS 和 EMCCD 的 QE 通常介于 80% 和 95% 之间。 EMCCD 和 sCMOS 探测器还提供较低的暗电流 PMT:EMCCDS (<0.001 e-)、sCMOS (<1 e-) 和 PMT(大约 2 e-)。

由于没有读取噪声,PMT 迅速成为市场领先的技术,但现代相机技术也提供低读取噪声。对于使用“EM 增益”的 EMCCD,可以实现 <1 e- 有效读取噪声,对于 sCMOS 模型,可以达到 1.1 到 1.6 e- 之间。

与 PMT 和混合探测器相比,基于相机的探测器(EMCCD 和 sCMOS)的整体灵敏度要高得多。

相机

相机选项通常包括 sCMOS、EMCCD 和多相机系统。

根据实验要求,sCMOS 和 EMCCD 选项都具有相对优势和劣势。 sCMOS 传感器的架构由于其更快的速度和更大视野的图像采集而提高了实验效率和吞吐量。

一些 sCMOS 探测器提供超快速成像和 6.5 µm 像素尺寸,非常适合在奈奎斯特条件中概述的典型放大倍率下进行采集。总体而言,sCMOS 代表了大多数常见成像应用的不错选择。

EMCCD 提供更高的灵敏度,使其成为极弱光成像条件或极微弱信号的最佳选择。 EMCCD 相机的极低暗电流也使其更适合长时间曝光应用;例如,发光研究。

大量的旋转圆盘共聚焦系统可以与两个相机一起工作。即使系统不需要两个摄像头,也建议瞄准可以容纳第二个摄像头的系统;因此为用户提供了适应未来实验要求的自由。在共聚焦系统上使用两个相机可以提高速度、灵活性和同时进行多色采集。

示例实验设置

在 sCMOS 的相机像素大小可以合并以匹配 EMCCD 并且每个相机的芯片大小匹配的系统中,同时双色成像是可能的;例如,当使用 2x2 binning 时,13 µm 像素的 EMCCD 相机与 sCMOS 相机的 6.5 µm 像素匹配。

该示例系统还将结合 sCMOS 的大 FOV 和较小的像素尺寸以及 EMCCD 的极低光成像能力。

选择的相机数量及其规格将影响显微镜系统的总体成本。应该注意的是,相机技术的改进有助于随着时间的推移进行模块化升级,并且系统的成像性能通常可以通过迁移到最新的探测器技术来提高。

哺乳动物细胞骨架。使用 iXon 888 EMCCD 相机通过蜻蜓旋转圆盘共聚焦显微镜获得的图像。

图 6。 哺乳动物细胞骨架。使用蜻蜓旋转盘共聚焦获得的图像 使用 iXon 888 EMCCD 相机的显微镜。图片由北京大学 Hao Hui Wen(孙宇杰实验室博士)提供。

显微镜支架

有多种品牌的显微镜支架可供选择,它们可以是直立的也可以是倒置的。

不同品牌的显微镜支架提供不同的选择。一个关键且经常被忽视的问题是支架的人体工程学设计。用户必须保持安全和舒适,因为他们花费大量时间在显微镜上工作、获取和组装系统。用户的舒适度也会影响他们的健康和工作效率。

需要在直立或倒立支架之间做出选择。这在很大程度上取决于所进行的实验类型;例如,电生理学实验和活体血管成像等活体实验通常需要一个直立的显微镜支架。然而,哺乳动物活细胞成像通常使用倒置支架进行。

用户必须考虑他们实验的预期性质,相应地选择显微镜支架的类型。

显微镜支架的端口数量也是一个重要因素。应该询问是否必须将其他成像、光刺激或光学设备连接到显微镜,无论是当前还是将来。例如,如果用户计划在显微镜支架上添加其他光学组件,则应选择双层显微镜。

双层显微镜支架的成本可能略高,但它允许用户为未来的应用需求保留他们的选择。将双层显微镜与光刺激设备一起使用也将确保改善样品可视化的用户体验。也可以为其他成像应用安装相机;例如,结合生物发光和荧光成像。

斑马鱼幼虫的神经系统。使用倒置显微镜支架通过蜻蜓转盘显微镜获得的图像。使用两个 Zyla sCMOS 相机、带通二向色 25 um 针孔和单带通发射滤波器同时采集。

图 7。 斑马鱼幼虫的神经系统。使用倒置显微镜支架通过蜻蜓转盘显微镜获得的图像。使用两个 Zyla sCMOS 相机、带通二向色 25 um 针孔和单带通发射滤波器同时采集。图片由尚帕利莫未知中心的 Ruth Diez del Corral 和 Davide Accardi 提供。

显微镜载物台

应在手动、电动或 XYZ 精密(压电)显微镜支架之间做出选择。

The 显微镜载物台 是一个关键因素——可以说是继展台之后最重要的因素。电动载物台会增加设备的成本,但这确实会提高工作效率,因为用户只需单击一下即可在 XYZ 上获取多个图块。电动载物台还有助于大面积、多视野、蒙太奇成像——大样本或完整组织的理想解决方案。

需要 XYZ 采集的实验也可能受益于基于压电的平台。压电控制阶段会增加成本,但这些为某些实验设置提供了明显的优势。

压电平台为 3D 成像提供具有纳米和亚纳米精度的平滑移动,以及出色的步进和稳定时间以及快速扫描。如果预算允许,压电控制平台是需要快速采集和高运动精度的实验的不错选择。

显微镜物镜

物镜是显微镜的重要组成部分,必须根据应用要求仔细选择。这是一项具有挑战性的任务,因为在每个放大倍数下都有大量可用选项。首先,用户必须选择显微镜的物镜数量,以及所需的放大倍数。

数值孔径 (NA) 是指物镜捕获更宽光线的能力 - 更宽的光锥相当于更高的分辨率,但更高的 NA 物镜价格昂贵。所需的分辨率是一个关键考虑因素,dSTORM 或全内反射显微镜 (TIRF) 等高端应用需要使用具有极高 NA (>1,4) 的物镜。

物镜的工作距离是必须考虑的特定于应用的要求。长工作距离物镜是可视化某些开发过程和在需要额外设备时方便获取样品的关键;例如,微注射针。较高的工作距离导致较低的 NA。

物镜的沉浸媒体也是一个重要的考虑因素。为了在避免衍射的同时最大限度地收集光线,物镜的浸没介质应提供尽可能接近样品浸没介质的折射率。

常用的浸入介质包括硅、油、水、空气和甘油。空气物镜通常更便宜,而浸没物镜通常更昂贵。

在为荧光成像选择物镜时,应注意并非所有物镜在所有波长下的透射率都是一样的。在考虑使用 NIR 和 UV 波长进行实验的光学器件时,应格外小心。例如,成像 DAPI 需要一个可以在紫外线范围内传输的物镜;在对 NIR 波长成像时,需要一个可以在这些波长下传输的物镜。

可以在各种物镜中校正由穿过玻璃的光引发的像差,但这些校正通常涉及额外的成本。

物镜可以是消色差或平面消色差、萤石、平面萤石、复消色差和平面复消色差。

消色差是最直接的物镜,校正较少,而平面复消色差在更多波长下提供更多校正;校正场曲、球面像差和色差。

“计划”意味着物镜已针对场曲进行了校正 - 失真会阻碍物体在平面上的正确聚焦,从而对图像质量产生不利影响。当预算限制允许购买时,场曲校正(计划)物镜是一个不错的选择。

球面像差是指到达物镜的光线在边缘周围出现畸变。它们更弯曲,不会与穿过物镜中心的光线聚焦在同一平面上,从而导致图像模糊。

消色差物镜校正一个波长的球差,而萤石物镜校正两个或三个波长,而平面消色差物镜校正三个或四个波长。

色差是未能将每个波长聚焦在同一平面上。在这里,消色差物镜校正两个波长,萤石物镜校正两个或三个波长,而平面复消色差物镜校正四个或五个波长。

还应探索物镜支持的技术,因为物镜不太可能支持所有成像方式。然而,一个物镜可以支持多种成像方式;例如:明场 (BF)、暗场 (DF)、相位对比 (Ph)、微分干涉对比 (DIC)、偏振 (Pol) 和荧光 (Fl)。

每个目标的最终成本将取决于此处概述的参数组合。选择具有兼容物镜的显微镜支架可以节省成本。

透射光

用户应了解覆盖在共焦荧光图像上的一系列透射光技术,以提供组织和细胞形状的概览。

明场较便宜,需要的光学元件也较不复杂,但通过这种技术几乎看不到大量细胞和组织。

相差显微镜确实增强了透射光图像的可见性,但许多图像仍然具有潜在的分散相位晕。

微分干涉对比提供了更高的分辨率和对比度,但 DIC 光学器件复杂,因此比明场或相差选项更昂贵。

根据所选的透射光技术,可能需要购买许多组件;例如,偏振器、相位板环和可以适应透射光技术本身的特定物镜。

孵化室

孵化室是实时成像应用的基本要求,有多种选择可供选择。

在考虑系统的应用和其他选项(例如,显微镜支架、载物台和显微注射设备)时,主要目标应该是完全集成共聚焦系统,以便每个组件都能协同工作并适合所需的应用。

在培养箱方面,用户可以选择能够与实验室中使用的载玻片或培养皿相匹配的平台顶部孵化器或底部平台孵化器,或者可以加热整个系统的大型孵化器。最后一个选项可能包括一个大型孵化器来预热系统和一个加热的样品架,以实现更高的样品精度。

选择培养箱时的主要考虑因素包括其温度范围、精度、温度随时间的稳定性以及冷却能力以达到较低的温度。

载物台孵化器可以是透明的,以便操作员在使用显微镜时更加舒适,也可以是黑色的,以防止不需要的光线进入成像系统。舞台培养箱也可以与 CO 结合使用2 incubator, should CO2 是实验的关键要求。

添加到孵化器的更多选项将导致额外费用;例如,这样的培养箱允许 CO2 控制将比只能控制温度的培养箱成本更高。

显微镜台

用户必须在刚性、主动或被动表之间进行选择。

刚性工作台不能隔离样品以防止振动,但如果结构足够坚固,它们可以提供低至 1 µm 的分辨率。因此,更敏感的应用需要高质量的桌子,能够吸收周围环境引起的任何振动。

某些应用程序(例如 STORM、SRRF-stream 和 TIRF)只能使用抗振台来执行。这些对于大块成像或延时成像等应用也非常有益,在这些应用中,匹配获取的块或移动连续帧至关重要。成本将根据所选的工作台而有所不同,通常与工作台可以提供的隔振级别一致。

作为一般规则,显微镜工作台提供的分辨率是:

  • 刚性:低至 1 µm
  • 无源:低至 0.01 µm
  • 有源:低至 0.001 µm

应该注意的是,这些数字是指示性的,购买前应咨询具体的表格规格。

用乙酰化微管蛋白染色的斑马鱼。使用 Sona 4.2B6 sCMOS 相机通过蜻蜓转盘显微镜获得的图像。

图 8。 用乙酰化微管蛋白染色的斑马鱼。 使用 Sona 4.2B6 sCMOS 相机通过蜻蜓转盘显微镜获得的图像。图片由阿尔加维大学的 Marco Campinho 提供。

其他光源

用户可以选择使用 LED、金属卤化物和氙气。

共焦系统通常需要通过目镜在视觉上选择样品的成像区域。用户不能为此​​使用激光光源,这意味着需要替代选项,例如 LED 光源、金属卤化物灯或氙气灯泡。

当前的 LED 光源可以以所需的波长激发样品,从而提供较长的使用寿命和相对较低的成本。 LED 光源还提供低能量的光,在筛选样品时减少光毒性和光漂白。这些优势已经让 LED 光源几乎取代了它们的金属卤化物和氙气灯。

还应考虑所需的波长数量,并且可能需要在系统中使用多条 LED 线。然而,系统可用的波长越多,光源就越贵。

超分辨率

提供多种超分辨率选项,包括 SIM、STED、STORM 和 SRRF-Stream+。

许多超分辨率技术通过利用可变激光强度、改进的光学和基于计算机的方法来提供增强的分辨率。

在成像需要更高的激光功率的情况下,该技术与活细胞超分辨率兼容的可能性较小。更复杂的技术需要更复杂的实现,通常会导致高昂的相关成本。

SIM 可提供低至 100 nm 的分辨率,同时与活细胞成像和宽场显微镜兼容。 SIM 可实现高达每秒 1 帧的速度,并可与任何荧光团一起使用;但它确实需要使用专门的光学元件,同时为样品提供比传统宽场方法更高的功率。 SIM 需要专用显微镜,因此这种技术在多模式共聚焦系统中通常不存在。

STED 可提供 40-50 nm 范围内的分辨率。 STED 的光学器件既复杂又昂贵,限制了该技术的可及性。超分辨率图像在 STED 采集期间立即交付,该技术不需要使用计算图像分析。 STED 还需要专用显微镜,这在多模式共聚焦系统中并不常见。

包括 STORM、dSTORM 和 PALM 在内的单分子定位显微镜 (SMLM) 技术利用选定分子的光活化来识别它们的位置。少量分子的重复激发(103 到 104 次)将能够提供超分辨率图像。 STORM 确实需要高可用的计算能力来分析图像,但不需要特殊的光学器件 - 使 STORM 成为比 STED 或 SIM 更具成本效益的选择。

SMLM 技术通常采用更高的激光功率,这使得它们与活细胞成像不兼容。 STORM 是一种宽场技术,可与 TIRF 照明结合使用。 SMLM 技术(PALM 和 STORM)提供超分辨率技术中最高分辨率,横向可达 10 nm。

SRRF(超分辨率径向波动)和 Andor 的 SRRF-Stream+ 都与活细胞成像兼容。 SRRF-stream+ 是一种经济高效的基于相机的方法,能够实现超分辨率,同时提供 100 nm 的横向分辨率。在某些成像条件下可以获得更高的分辨率,并且该技术不需要复杂的样品制备步骤。它还能够在细胞和组织深处提供超分辨率图像。

SRRF-Stream+ 提供的分辨率改进类似于通过 SIM 实现的分辨率改进,但 SRRF-Stream+ 提供了一种更简单、更具成本效益的基于相机的方法来提高现有系统的分辨率。

BPA 细胞用鬼笔环肽(红色)、mitotracker(绿色)和 DAPI(蓝色)染色,其中使用 Ixon 888 Ultra 在共聚焦模式(无 SRRF)和使用 SRRF-stream+ 的共聚焦模式下成像。使用 Ixon 888 EMCCD 相机通过蜻蜓转盘显微镜获得的图像。

图 9。 BPA 细胞用鬼笔环肽(红色)、mitotracker(绿色)和 DAPI(蓝色)染色,其中使用 Ixon 888 Ultra 在共聚焦模式(无 SRRF)和使用 SRRF-stream+ 的共聚焦模式下成像。使用 Ixon 888 EMCCD 相机通过蜻蜓转盘显微镜获得的图像。图片来自英国贝尔法斯特牛津仪器公司 Andor 的 Claudia Florindo

3D风暴

如果需要通过 dSTORM 确保最大分辨率,能够提供 3D 超分辨率图像的设备是理想的选择。

散光透镜会导致 PDF 失真,从而提供了一种提供 3D-dSTORM 图像的优雅方式。 PSF 失真对 X 和 Y 维度上的差分正负轴向偏移进行编码,这可以转换为轴向位置,从而能够创建 3D 超分辨率图像。

Andor Dragonfly 具有集成散光透镜选项,适用于 3D-dSTORM 图像采集。建议在购买时确定是否需要 3D-dSTORM。购买后可以添加此选项,但这需要将系统返回工厂 - 导致设备停机并增加成本。

点扩散函数 (PFS) 表示成像系统对点物体的响应。当光线穿过光学系统(镜头和其他成像组件)时,由于系统光学组件的特性,该光线会失真。

如果图像模糊,则无穷小的点不会作为点出现,并且结果图像被认为是卷积的。因为 PSF 在所有成像空间和所有被成像对象中都是相同的,所以可以使用数学过程来恢复模糊 - 去卷积,有效去除任何“雾”并以更高的清晰度显示真实对象。

TIRF

用户应在单色、双色、同步 TIRF 和同步双色 TIRF 之间进行选择。

全内反射 (TIRF) 显微镜能够获取样品表面附近物体的高度详细图像。 TIRF 显微镜旨在迫使光线以 TIRF 角度到达载玻片的边缘,尽管光路中有障碍物。 TIRF 将允许从样品顶部进行最大 100-200 nm 的成像,但这种照明方法的一个影响是只能在玻璃/水界面的非常薄的边界处获取图像。

TIRF 系统提供的高分辨率使其成为单分子成像的良好选择,这也意味着 TIRF 成像可以与 dSTORM 采集相结合。

TIRF 为分析细胞膜边界或细胞表面的活细胞事件提供了强大的解决方案;例如,囊泡运输、膜动力学、内吞作用和胞吐作用。

在需要TIRF的情况下,应考虑软件是否可以校正穿透深度角,是否进行双色TIRF调整每个波长的穿透角。

专用 TIRF 系统将比多模式共焦系统更具成本效益,但该系统将仅限于 TIRF 成像。如果需要 TIRF 作为多模式共聚焦系统的一部分,该功能由 Andor 的 Dragonfly 系统提供。

多模式系统

许多研究实验室和核心设施可以从采用多模式系统中受益,该系统可提供所有模式的高质量图像。核心设施的成像要求广泛多样;多模式系统将提供多种成像选项,允许并行运行多个不同的成像项目。

随着研究实验室的研究结果和发现取得进展,可能需要进一步的成像方法。多模式系统将提供这些场景所需的额外多功能性,而无需购买额外的设备。

宽场系统在处理样品方面通常快速而温和,使其成为固定细胞或薄生物的实时成像的明智选择;例如,酵母、细菌、微藻和单层细胞。然而,宽场系统不提供光学切片,因此不适合用于厚且高散射的样品。

共聚焦系统是一种能够进行光学切片的显微镜。这些系统使用针孔来丢弃散焦的光。共聚焦显微镜有两种类型:点扫描共聚焦(其中单个针孔丢弃散焦光)和多点共聚焦(旋转圆盘——多个针孔丢弃散焦光)。

单点共聚焦提供深入样品的能力,但它们明显比多点共聚焦慢,因为它们逐点扫描。点扫描共聚焦的整体光捕获效率低于旋转圆盘,导致需要使用更高的激光功率来可视化样品。在实时成像实验的情况下,较高的激光功率将导致样品光漂白增加,以及光毒性和光损伤。

传统上,由于针孔串扰,多点共聚焦无法深入样品。 Andor 的 Dragonfly 提供了最佳的针孔间距设计,但有助于在厚样品中成像高达一毫米的深度。 Dragonfly 还拥有高效、温和的样本照明,非常适合实时样本,同时在共焦模型中提供高达 400 帧/秒的速度。

如前所述,TIRF 成像是一种专门的显微镜技术,非常适合对活细胞表面事件或细胞/基质附着相互作用进行成像。由于需要专门的光学组件来实现 TIRF 成像,因此在构建系统时必须包含这些组件 - 追溯包含 TIRF 功能既复杂又成本高昂。

超分辨率代表了可视化小于 200 nm 的结构的能力——这是许多生物项目中必不可少的工具。许多选项可用于超分辨率,每个选项都有自己的优点和缺点。拥有多个可用的超分辨率选项将提高系统的多功能性。

最理想的系统将结合宽场、共焦、TIRF 和超分辨率功能,以实现可靠的多模态成像。 Andor Dragonfly 就是这样一个系统,无论成像模式如何,都能提供卓越的质量和高速:宽场、TIRF、共聚焦和超分辨率选项(dSTORM 和 SRRF-Stream+)。

Dragonfly 是寻求在单个系统中结合所有成像模式的用户的绝佳选择,具有成本效益。

成年斑马鱼的大脑和脉管系统,使用 Andor Dragonfly 500 和双摄像头同时采集获得的多图块图像。在图像采集过程中进行了多块拼贴、拼接和在线解卷积。

图 10。 成年斑马鱼的大脑和脉管系统,使用 Andor Dragonfly 500 和双摄像头同时采集获得的多图块图像。在图像采集过程中进行了多块拼贴、拼接和在线解卷积。图片由 NorMIC(奥斯陆大学)的 Julien Rességuier 提供。

采集软件

采集软件必须能够与所需的成像模式和应用程序集成。还建议根据应用程序是否需要这些基本软件包和任何额外模块以及任何成本影响来评估它们。

大多数共聚焦系统的基本软件包包括延时、Z 堆栈、多点和多通道实验以及 6D 实验(三通道、时间、多模式采集 - 不同通道、时间和 Z)的功能。

显微镜采集软件包中可以包含更多标准或可选工具;例如,瓦片成像、马赛克成像、2D和3D拼接、实时拼接、反卷积、实时反卷积和多井集成。

选择采集软件时的关键考虑因素是该软件足够强大,可以方便所有所需的应用程序。

为了进一步提高灵活性,还值得考虑具有脚本功能的软件以及通过脚本与外部设备集成的能力。随着研究或项目的发展或扩展,这将确保为新应用提供足够的灵活性。

分析软件

可视化和分析软件也是一个重要的考虑因素。理想情况下,该系统应该集成在一起,以允许采集和分析软件作为高效工作流程的一部分进行通信。

分析包应包括提供分析和帮助回答实验问题所需的任何统计数据的工具;例如,分析细胞内斑点(细胞器)和细胞内距离的能力、细胞追踪(3D 和 2D)能力、神经突分支分析、脊柱密度和细胞周期。

解卷积选项是必不可少的。如果这未包含在采集软件中,则必须将其集成到分析包中。解卷积很重要,因为显微图像会因光子穿过玻璃时的行为方式固有的光学过程而扭曲。一个无穷小的点不会在图像中显示为一个点,但它会表现出该光学系统的色散特性。

有一些方法可以显着减少这种模糊。一个非常有效的方法是使用共聚焦。尽管如此,总会有一些卷积,因此要获得真正代表对象的图像,应该对原始数据进行去卷积。

在处理需要多个成像块的样品时,应将拼接器视为分析包的额外模块;例如,连续样本或大型生物体。拼接器必须能够处理大数据集,快速有效地连接所有图块,同时允许图块之间有一些重叠以提供连续图像。

在需要重复分析的地方,应考虑批量分析能力。一旦定义了分析参数,此功能允许分析批量自动化。

分析和渲染软件应该能够提供统计数据,并通过提供多种渲染和可视化模式以最合适的方式呈现这些数据。

通常,分析软件包包含的模块越多,成本就越高。然而,应该注意的是,通过减少分析时间和卓越的输出数据质量,可以收回对强大图像分析软件的投资。

哺乳动物细胞呈递肌动蛋白、线粒体和 DNA。使用 Andor Dragonfly 500、iXon 88 相机和使用 SRRF-Stream+ 成像模式获取的图像。图像是使用 Imaris 9.7 处理的。肌动蛋白丝(黄色)与表面成分分开。

图 11。 哺乳动物细胞呈递肌动蛋白、线粒体和 DNA。使用 Andor Dragonfly 500、iXon 88 相机和使用 SRRF-Stream+ 成像模式获取的图像。图像是使用 Imaris 9.7 处理的。肌动蛋白丝(黄色)与表面成分分开。图片来自英国贝尔法斯特牛津仪器公司 Andor 的 Claudia Florindo

维护包

当前的 共聚焦显微镜 是提供卓越品质的高端设备,但仍必须对这些设备进行微调,以始终如一地满足购买时设定的质量标准。尖端仪器的定期维护是必不可少的。

购买显微镜时,购买协议中通常包含标准保修,而购买者通常可以购买扩展维护包,以确保设备在使用的头几年得到有效维护和校准。

一旦初始保修期满,大多数显微镜公司将提供三种类型的维护包:基本、中等和全覆盖。

基本包通常具有预先定义的站点访问次数(以诊断和解决问题)和预防性维护访问。然而,更换零件通常不包括在内。

中包通常包含基本包的内容和设备部件的更换 - 在大多数情况下不包括激光器更换。

Full Coverage 套餐通常是最昂贵的,但该套餐的特点是出勤率高,以及解决问题的无限制呼叫。该套餐还提供全面的维护服务,包括所有更换部件、差旅费用和咨询费用 - 为用户提供的综合优先服务。

在预算允许的情况下,全覆盖套餐是最好的 - “无头痛” - 解决方案。具有远程诊断和协助功能的维护包也可以加快支持过程。

大多数组织需要在成本效益和服务质量之间取得平衡,因此建议选择提供远程诊断和帮助以及可靠和高质量支持的支持合同。

维护包的价格和覆盖范围的总体比较。

图 12。 维护包的价格和覆盖范围的总体比较。图片来源:安道尔科技有限公司

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    安道尔科技有限公司. (2021, August 12). 什么影响共聚焦显微镜的价格?. AZoOptics. Retrieved on September 27, 2021 from //www.selec-iat.com/Article.aspx?ArticleID=1983.

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    安道尔科技有限公司。“什么影响共聚焦显微镜的价格?”。 偶氮光学. 27 September 2021. .

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    安道尔科技有限公司。“什么影响共聚焦显微镜的价格?”。 AZoOptics. //www.selec-iat.com/Article.aspx?ArticleID=1983. (accessed September 27, 2021).

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    安道尔科技有限公司。2021。 什么影响共聚焦显微镜的价格?. AZoOptics, viewed 27 September 2021, //www.selec-iat.com/Article.aspx?ArticleID=1983.

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