拉曼光谱概述和产品解决方案

非弹性散射辐射的波长变化提供了化学和结构信息。拉曼位移光子可以具有更高或更低的能量,这取决于所研究分子的振动状态。右侧显示了说明这些概念的简化能量图。

简化的能量图

简化的能量图

斯托克斯辐射的能量比瑞利辐射低(波长更长),而反斯托克斯辐射的能量更大。能量的增加或减少与分子基电子态的振动能级有关,因此,观察到的斯托克斯和反斯托克斯特征的拉曼位移是分子振动能的直接量度。拉曼光谱示意图如下所示。

对于斯托克斯线,散射辐射的能量小于入射辐射,而对于反斯托克斯线,散射辐射的能量大于入射辐射。激发产生的能量增加或减少与分子基电子态的振动能量间距有关,因此斯托克斯线和反斯托克斯线的波数是分子振动能的直接量度。

在示例频谱中,请注意斯托克斯线和反斯托克斯线与瑞利线的位移相等。这是因为在任何一种情况下都会获得或失去一个振动能量量子。另请注意,反斯托克斯线的强度远低于斯托克斯线。这是因为只有在辐射之前被振动激发的分子才能产生反斯托克斯线。因此,在拉曼光谱中,通常只测量更强的斯托克斯线,拉曼散射是一个相对较弱的过程。散射的光子拉曼数量非常少。然而,有几个过程可用于提高拉曼测量的灵敏度。

拉曼技术

共振拉曼

如果激发激光的波长与分子的电子吸收一致,则与吸收生色团相关的拉曼活性振动强度增强了 10 倍2 to 104.这种共振增强或共振拉曼效应非常有用,不仅可以显着降低检测限,还可以引入电子选择性。因此,共振拉曼技术用于提供对感兴趣物种的结构和电子洞察。金属卟啉、类胡萝卜素和其他几类重要的生物分子在可见光中强烈允许电子跃迁,使它们成为共振拉曼光谱的理想候选者。共振选择性具有进一步的实际用途,因为发色部分的光谱共振增强,而周边环境不行。对于生物发色团,这意味着吸收活性中心可以通过可见光激发波长进行特异性探测,而不是周围的蛋白质基质(这将需要紫外激光引起共振)。共振拉曼光谱也是研究金属中心配合物、富勒烯、聚二乙炔和其他在可见光中强烈吸收的“奇异”分子的化学性质的重要手段。尽管有更多的分子吸收紫外线,但该光谱区域的激光器和光学器件的高成本限制了紫外 (UV) 共振拉曼光谱仅适用于少数专家组。

示意图拉曼光谱

示意图拉曼光谱

共振增强的振动分为两个或三个一般机械类别。最常见的情况是 Franck-Condon 增强,其中振动法向坐标的分量发生在分子在电子激发期间膨胀的方向上。分子在吸收光时沿该轴膨胀得越多,增强因子就越大。卟啉的易于可视化的环呼吸(面内扩展)模式属于这一类。通过称为振动增强的机制,耦合两个电子激发态的振动也会共振增强。在这两种情况下,增强因子大致遵循吸收光谱的强度。更完整的共振增强理论超出了本节的范围。

共振增强不会在明确定义的波长处开始。事实上,如果激发激光在分子电子跃迁以下甚至几百个波数内,则观察到 5 倍到 10 倍的增强。这种“预共振”增强在实验上是有用的。

表面增强拉曼散射 (SERS) 拉曼

来自吸附在结构化金属表面上或什至几埃内的化合物(或离子)的拉曼散射可能比溶液中的拉曼散射大 103 到 106 倍。这种表面增强的拉曼散射在银上最强,但在金和铜上也可以观察到。在实际激发波长下,对其他金属的增强并不重要。

SERS 产生于两种机制:

  • 第一个是在金属表面产生的增强的电磁场。当入射光的波长接近金属的等离子体波长时,金属表面的传导电子被激发成扩展的表面电子激发态,称为表面等离子体共振。吸附或靠近表面的分子会经历异常大的电磁场。垂直于表面的振动模式得到最强烈的增强。
  • 第二种增强模式是通过在表面和分析物分子之间形成电荷转移复合物。许多电荷转移配合物的电子跃迁是可见的,因此发生共振增强。具有孤对电子或pi云的分子表现出最强的SERS。这种效应首先是用吡啶发现的。其他芳香族含氮或含氧化合物,例如芳香胺或苯酚,具有很强的 SERS 活性。

使用其他富电子官能团(例如羧酸)也可以看到这种效果。表面等离子体共振的强度取决于许多因素,包括入射光的波长和金属表面的形态。波长应与金属的等离子体波长相匹配。对于 5μm 银颗粒,这大约为 382 nm,但对于较大的椭圆形银颗粒,可能高达 600 nm。铜和金的等离子体波长为 650nm 的红色,另外两种金属在 350-1000 nm 范围内的波长下显示 SERS。表面等离子体共振激发的最佳形态是小 (<100nm) 粒子或原子级粗糙表面。SERS 通常用于研究吸附在金属上的单层材料,包括电极。其他流行的表面包括胶体、介电基板上的金属膜,以及最近通过短连接与金属或介电胶体结合的金属颗粒阵列。尽管 SERS 允许从微摩尔 (10x-6) 范围内的溶液浓度轻松观察拉曼光谱,但定量测量的不可再现性在过去损害了其用于分析目的的效用。然而,SERS 活性介质生产的标准化也在稳步提高其在该领域的潜力。

紫外共振拉曼光谱 (UVRRS)

UVRRS 是复杂生物系统分子分析的强大工具。大多数生物系统吸收紫外线辐射,因此能够提供与紫外线拉曼激发共振的能力。这导致高度选择性的共振拉曼效应能够增强重要的生物目标,如蛋白质或 DNA。例如,200nm 附近的激发增强了来自酰胺基团振动的拉曼峰; 220nm 附近的激发增强了某些芳香族残基的峰。来自水的拉曼散射很弱,允许分析非常弱的水系统。

由于 UVRRS 的选择性,通常需要可调谐激光器作为激发源。由于真正可调谐的连续波激光器尚不可用,具有倍频输出的 Nd:YAG 泵浦染料激光器是一种合适的 UVRRS 系统。根据所使用的染料,该激光器设置几乎可以提供任何所需的 UV 波长。增强型 CCD带有紫外线光电阴极的 (ICCD)、背照式 CCD 或带有紫外线增强 (BASF lumogen) 涂层的 CCD 可用作 UVRRS 的检测器。使用这些检测器是因为它们具有高检测效率和多通道能力。 UVRRS 和光纤光谱世界融合的主要障碍是日晒,紫外线辐射导致光纤不透明的过程(甚至非常纯二氧化硅纤维)。这种不透明度会影响传输,使标准光纤对 UVRRS 毫无用处。

光纤 UVRRS 配置

光纤 UVRRS 配置

时间分辨和脉冲拉曼

振动拉曼光谱现在被广泛认为是一种用于稳定物质化学分析的有用技术,因为支撑拉曼测量的技术已经成熟。同样,时间分辨拉曼光谱也已成为表征瞬态化学物质的极好方法。许多降低成本并提高传统拉曼系统可靠性的技术进步也可用于瞬态物质的研究.

感兴趣的物种

感兴趣的物种

脉冲激光通常用于研究短寿命物种。可以向分子系统提供具有足够能量的激光脉冲,以重新分配分子中的电子,从而形成激发态,如右图所示。这种激发态分子的拉曼光谱可以使用相同的激光脉冲或来自第二个激光(单色和双色脉冲拉曼)的不同脉冲进行研究。感兴趣的激发态可以具有从皮秒到毫秒的寿命,但是大多数可以使用 5ns 数量级的门控进行研究。由于大多数激发态是使用紫外线和可见光激光产生的,因此具有高紫外线和可见光量子效率 (QE) 的光电阴极通常是合适的。

使用 ICCD(内部触发或外部触发)的单色拉曼

最简单的脉冲激光实验是所谓的单色实验,其中使用高辐照度激光脉冲来引发光反应,然后拉曼探测脉冲宽度内产生的瞬态物质。通过打开增强管,如右图所示,只记录激发态的拉曼光谱。这种脉冲/ICCD 门组合将被重复和累积数百到数千次,以实现具有高动态范围的良好整体信噪比。

基本脉冲激发态拉曼示意图

基本脉冲激发态拉曼示意图

使用 ICCD 和两个激光器的两色拉曼(内部触发或外部触发)

在时间分辨共振拉曼 (TR3) 光谱中,不同波长的激光脉冲对用于光解(光学“泵浦”),然后拉曼探测感兴趣的瞬态物质。选择光谱仪/探测器的光谱窗口,以便它对应于来自探测激光的拉曼散射的频率范围。

泵浦探针(两种颜色)拉曼示意图

泵浦探针(两种颜色)拉曼示意图

瞬态信号的时间演变通过在光解事件后的不同延迟下记录一系列光谱来监测,即在激发和探测脉冲之间的一系列时间延迟。 ICCD 相机(例如 Andor 型号 DH720-18F-03)或任一激光器都可以提供触发器。延迟发生器用于控制延迟。

在延迟发生器的控制下具有延迟的脉冲两色拉曼布局

在延迟发生器的控制下具有延迟的脉冲两色拉曼布局

时间延迟序列

时间延迟序列

共聚焦拉曼显微镜

在拉曼显微镜中,研究级光学显微镜与激发激光器和光谱仪耦合,从而产生一个能够获得传统图像并另外从接近衍射极限(~1 微米)的样品区域生成拉曼光谱的平台。成像和光谱可以结合生成“拉曼立方体”、3 维数据集,在 2D 图像的每个像素处产生光谱信息。电动 xyz 显微镜载物台可用于自动记录光谱文件,这将构成从预选点记录的拉曼图像、拉曼图或一组拉曼光谱。特定的软件例程将允许快速轻松地重建这些图。使用各种特殊功能生成样本的二维和三维图像的可能性,是传统光谱学或显微镜的明显优势。

拉曼仪器和设置

第一台拉曼“仪器”建于 1928 年。该仪器使用单色化的太阳光作为光源,用人眼作为检测器。拉曼仪器被开发出来(基于弧光灯和照相板)并且很快变得非常流行,直到 1950 年代。从这些早期开始,拉曼仪器已经有了显着的发展。现代仪器通常由激光器、瑞利滤波器、几个透镜、光谱仪和检测器(通常是 CCD 或 ICCD)组成。

激光

色散拉曼的主要优点之一是它提供了选择最佳激光激发波长以记录最佳拉曼信息的可能性。例如,可以选择波长以提供与所研究样品的最佳共振。

典型的连续波 (CW) 拉曼布局

典型的连续波 (CW) 拉曼布局

人们可能还需要调整波长以避免荧光和热发射背景。如今,可以使用从 UV(低至 200nm)到红外线(1.06µm Nd:YAG 激光线),从 microWatts 到更高的激光线到几瓦。

用于拉曼光谱的 Andor 解决方案

探测器

目前的大多数色散拉曼装置现在都配备了多通道二维 CCD 检测器。这些探测器的主要优点是高量子效率、极低水平的热噪声(当有效冷却时)、低读取噪声和可用的大光谱范围。 存在许多 CCD 芯片,提供前照式和背照式格式,但最常见的光谱传感器格式之一是背照式 1024 x 256 像素阵列,包含 26 x 26 微米。成本和性能之间的斗争中的一个很好的折衷是开放电极芯片,就像在 安道尔 iDus 型号 DU420A-OE.最近发现深度耗尽芯片可用于改进 NIR 拉曼检测,适用于 785nm 激光器。事实上,深耗尽型传感器比更传统的传感器具有更高的暗电流,这意味着在这些设备中应用有效的热电 (TE) 冷却尤为重要。其他具有较小像素尺寸的芯片也可用于提高光谱分辨率,例如,使用传感器的 Andor iDus DU440A:2048 x 512 像素,13.5 x 13.5µm。然而,必须始终牢记,将频谱分散到更多的较小像素上会产生信噪比的影响。

拉曼光谱学家在使用 CW 激光器时,通常需要较长的曝光时间(1 秒到 20 分钟)以达到所需的信噪比,并且在这些情况下不需要多兆赫读出相机。然而,在许多情况下必须应用更短的曝光时间,例如在快速反应、温度跳跃实验以及高通量拉曼映射时。在这些情况下,传感器的读取本底噪声会显着影响整体信噪比。此外,在许多情况下,光级基本上或必然较低,例如在研究光不稳定分子时,或当探测物种的浓度较低时。同样,这会使读取本底噪声更加显着。在这些情况下,我们建议使用 Andor NewtonEM EMCCD 平台,该平台提供了在较慢读取速度下的常规读取和在慢速或快速读取速度下的单光子灵敏度之间的选择。一个 EMCCD 放大器,全部具有传感器背照式提供的高 QE。在灵敏度、速度和灵活性方面,牛顿代表了光谱检测性能的绝对极限。

已经表明,光谱红端的CCD量子效率随着冷却而降低,而蓝色端的QE增加。 低温TE冷却系统的灵活性是热电冷却明显优于液氮的原因之一冷却。

与拉曼光谱相关的 QE 曲线

与拉曼光谱相关的 QE 曲线

由于拉曼需要光谱仪,通常使用细长的光谱芯片(除非使用阶梯光谱仪)。由于拉曼基本上是一种弱光现象,暗电流很重要,因此成像光谱仪和单道模式可以成为首选。使用小的单轨也会减少宇宙射线的发生。

光谱仪

拉曼光谱使用最广泛的光谱仪配置是 Czerny-Turner,例如 Andor Shamrock 303i 或 Shamrock 163i。 Czerny-Turner 光谱仪在离轴配置中使用反射镜作为准直器,并在准直空间中使用平面反射光栅,如右图所示。

车尔尼-特纳布局示例

车尔尼-特纳布局示例

也可以使用凹面全息光栅光谱仪。这是单元素光谱仪。反射光栅形成在弯曲的聚焦表面上以产生离轴光谱仪。光栅通常是带有反射涂层的全息表面浮雕图案。这是最简单的光谱仪设计,因此非常紧凑且便宜。

Andor Mechelle:Mechelle 光谱仪中的 Echelle 光栅是一种频率非常低的反射光栅。与标准凹面全息或 Czerny-Turner 设计相比,此类光谱仪的优势如下:

  • 没有活动部件
  • 宽光谱覆盖和高分辨率,同时
  • 收集完整光谱的时间大大减少
  • 紧凑、坚固的设计
  • 折射光学系统提高了成像性能
  • 由于采用快速折射光学元件,可与光纤设备有效耦合

瑞利滤波器

瑞利散射是与激光波长相同的弹性散射光,因此拉曼光谱学家不感兴趣。瑞利散射非常强烈(通常比拉曼散射强一百万倍),如果让这种光进入光谱仪,它会非常强烈,以至于几乎看不到任何拉曼光谱。为此,必须去除瑞利散射。消除这种光有两种主要技术:

  • 抑制滤光片:介电滤光片、全息陷波滤光片和有色玻璃滤光片。
  • 减法双光谱仪:在减法模式下运行的双光谱仪通常用作瑞利滤波器。这之后通常是单个色散光谱仪。 “三重”光谱仪非常耗光,吞吐量非常低(~10%)。它的优点是它几乎是无限可调的。

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