在共聚焦拉曼成像 - 一个拉曼光谱的采集时间是一个关键的价值

在共聚焦拉曼成像中,一个拉曼光谱的获取时间是关键值,因为它影响图像的采集时间,该图像通常由数万种拉曼光谱组成。本文介绍了如何使用光谱型EMCCD作为探测器,可以显着将采集时间降低到每种频谱的几毫秒,以及巨大提高敏感性。

共聚焦显微镜后面的工作原理

共聚焦显微镜使用点光源(laser)这集中在样品上。反射(fluorescence)光通常用相同的目标收集,并聚焦到检测器前面的针孔中。这确保只有来自图像焦平面的光线可以到达检测器,这强烈增加图像对比度,并且具有正确选择针孔尺寸,略微增加分辨率。

在共聚焦拉曼成像中,如在这里描述的实验的alpha300 R系统中,使用特殊滤光器来抑制反射的激光,同时通过光谱仪/ CCD相机组合能够检测拉曼散射光。为了获得图像,在非常短的时间内获得数千个光谱,通常小于每光谱的100ms积分时间。

随着拉曼散射横截面非常小,激励力量仅限于几毫瓦,如何提高共焦拉曼系统的整体敏感性?

优化S / N比提高了CRM系统的整体敏感性

优化的重要因素是信噪比(S/N)。第一步是改善收集的拉曼信号。这可以通过优化显微镜和光谱仪的吞吐量,并通过使用高数孔径的目标来完成(NA)。共聚焦设置有助于减少来自焦点外区域的不需要的背景信号,进一步增强S / N。

使用具有最高灵敏度的合适探测器

接下来是选择具有最高灵敏度的合适探测器,例如背部照射CCD,其可以具有超过90%的量子效率。探测器本身的主要噪声源是暗噪声和读出噪声。目标必须是消除所有其他噪声源,因此只有光子拍摄噪声仍然存在。

由于光子遵循泊松统计,对于给定信号,不确定度是电子中信号的平方根。在没有其他噪声源的情况下,对于100个电子的信号,S / N不能大于10。

暗噪声降低了CCD的冷却效率

暗噪声是由于CCD中的热产生的载波,通过高效冷却CCD可以显着降低。良好的CCD在-60时具有小于0.01电子/像素/秒的热暗电流°C.因此,冷却低于-60°C不是几秒钟的集成时间所必需的。对于小于100毫秒的集成时间,如在共聚焦拉曼设置中,暗电流完全可以忽略不计。在将收集的电子转换为数字计数时产生读数噪声,并受CCD的质量的限制'S读数放大器以及速度(digitization rate)读数过程。读数噪声由相机制造商指定,并在电子中给出。典型值为5-10电子,用于50kHz读出率为2.5MHz读出率为约30个电子。

读出噪声限制

如果读出噪声超过光子拍摄噪声,则据说信号被读出噪声限制。在正常的光谱实验中,可以简单地增加积分时间来获取足够的信号,以确保信号被射击噪声再次受到限制。不幸的是,共焦拉曼显微镜中并不总是可以的。

如果获取由128像素/线和128行组成的图像,则只有1秒的集成时间/频谱,总获取时间为4,5小时,这是100毫秒集成时间的小于30分钟或10毫秒的集成时间不到3分钟。不幸的是,探测器的读出速度越快,读出放大器的噪声是噪声。

配备50 kHz读数放大器的1024x128像素CCD可以在大约22毫秒内读出,这也是最短的集成时间。如果我们假设10个电子的读数噪声,则每一个信号/像素低于100个电子/像素都会被读出有限(Poisson noise < readout noise)。如果读出噪声是快速读出放大器的30个电子,即使是900电子的信号也是如此(探测器上的1000个光子/像素)将被读数有限。

什么是电子乘以CCD

电子乘以CCD(EMCCD)是一个正常的CCD,具有额外的读出寄存器,其具有比正常的CCD读数寄存器更高的时钟电压。由于这种高时钟电压,通过碰撞电离的电子乘法通过可调节的总扩增的信号达到高达1000次。利用该设置,始终可以放大读出噪声上方的信号,使得S / N比总是受到信号的泊松噪声的限制,即使使用非常快的读出放大器。作为示例,具有2.5MHz读数放大器的1600 x 200像素EMCCD,如本文中的实验所用,只能在2.3毫秒中读出。

计算不同信号的S / N的改进的计算

以下计算显示了可以预期不同信号的S / N的改进。假设量子效率(QE)CCD为90%,并且信号的放大被设置为一个A / D计数等于读出噪声的电子数量(1 A / D计数= 30个电子,用于2.5 MHz读数放大器).

如果在给定积分时间中100个光子落在CCD像素上,则将生成90个电子并转换为3A / D计数。读出噪声为1A / D计数,泊松噪声为9.5,约为0.3 A / D计数。通过这些数字,S / N比率约为2.6。

在EMCCD中,信号将乘以可高达1,000的电子增益因子。通常使用较小的放大因子,但是对于计算它不会产生差异。 90电子将被放大至90,000个电子,导致3,000 A / D计数。泊松噪声是9,500电子,它转换为317计数,而1计数读数噪声完全可以忽略不计。 S / N为9.5,这是一个增加3.6的改善。

如果信号仅为10光子,则会导致正常CCD仅0.3计数的信号。在这种情况下,泊松噪声可以忽略。通过1计数读数噪声,S / N是0.3,几乎不可检测的信号。

对于EMCCD,信号为333计数,泊松噪声是100计数,其提供3.3的S / N,在正常CCD上提高11倍。

实际上,电子乘法过程本身增加了额外的,所谓的多余噪声系数约为1.4,因此对于上述示例,S / N的真实改进分别减少到2.6和7.9。

对于更高信号,其中信号强度不再读出限制,EM过程的过量噪声系数将EMCCD的S / N比降低到正常CCD的S / N比。在这种情况下,可以关闭EM寄存器然后"normal"使用读数寄存器。因此,EMCCD表现正常作为正常的背部照射CCD。

聚合物样品的共聚焦拉曼图像

图。图1示出了极薄的PMMA膜的三个共焦拉曼图像,旋涂到玻璃基板上。在图像的中心,用金属针制成垂直划痕以去除PMMA层。用跨越该划痕的AFM测量的膜厚度为7.1nm。观察到厚度为4.2nm的额外污染层。最初未知该污染层的原点和材料组合物,但可以通过共聚焦拉曼测量来确定。

(a) - (c)在3000 / cm的CH2拉伸带中获得的玻璃上的7.1nm薄PMMA层的共焦拉曼图像。秤栏:10µm。 (d)样品示意图30 x 50µM,100 x 80像素= 8000谱,110ms /频谱。

图1. (a)-(c)在CH2拉伸带中获得的玻璃上的7.1nm薄PMMA层的共聚焦拉曼图像约为3000 / cm。秤栏:10µm. (d)样品示意图30 x 50µM,100 x 80像素= 8000谱,110ms /频谱。

通过在50×50mm的扫描范围内获得200×200拉曼光谱并将PMMA的CH2拉伸带的强度约为3000 / cm来获得图像。激励力量为20 mW @ 532nm,使用100倍,NA = 0.9目标。图。用标准的背部照射获得1A(BI)CCD使用62 kHz读数放大器和36毫秒集成时间/频谱。通过一点想象,图像中心的划痕仅可见,但S / N比远小于1。

图。图1B示出了与具有约250的增益的EMCCD成像的样本的相同部分。该图像显示几乎相同的S / N,但现在积分时间仅为3.6ms,比图像1a更快地提高10倍。完整的图像采集需要25分钟的图像1A,但图像1B仅3.4分钟。图。图1C是用EMCCD拍摄的,但现在具有与图1中相同的积分时间。1A。人们可以清楚地看到划痕,也可以在稍后讨论的PMMA和玻璃表面上的针状结构形式的污染。图。图1D显示了样品的草图。

对于下一个图像,使用样品颠倒,使用具有Na = 1.4的油浸没物镜。集成时间为7ms /频谱,导致总获取时间为5.4分钟(包括后扫描的0.3s /线)。图。图2示出了在与16 x到1,000 x的不同增益设置的相同条件下获取的12个图像。同样,CH2拉伸带周围的信号被集成以获得图像。可以看出,S / N比强烈增加到约200 x的增益设置。在此之上,在图像中不再看到S / N的进一步改进。

使用不同设置的EMCCD增益获取的共聚焦拉曼图像的比较。

图2。使用不同设置的EMCCD增益获取的共聚焦拉曼图像的比较。

在图1中。如图3所示,来自PMMA的CH2拉伸带的信号的S / N比被绘制针对EMCCD增益。信号的标准偏差被视为噪声。可以看出,信号增加到300倍的增益,这似乎是最佳设置。高于此值,S / N值再次略微减少。使用适当的增益因子,总体改善超过5倍。

S / N. ratio of the signal from the CH2 PMMA的拉伸带绘制反对EMCCD增益。

图3.。 S / n来自CH的信号的比率2 PMMA的拉伸带绘制反对EMCCD增益。

鉴定污染物

由于辅助深度分辨率有限,所获得的频谱都不是纯PMMA光谱或污染层的纯光谱。然而,通过在没有污染的情况下平均在划痕区域中获得的所有光谱,获得纯玻璃谱。

通过随后从PMMA谱除以玻璃谱,以及从污染的光谱,可以计算纯PMMA和污染光谱。将这些光谱进行基础分析,其中每个测量的光谱装配为基本光谱的线性组合。使用此技术,三个图像具有三个组件的分布(玻璃,PMMA和污染)可以获得颜色编码的(蓝色=玻璃,红色= PMMA和绿色=污染)可视化他们的分发(Fig. 4).

Color-coded confocal Raman image of a 7.1 nm PMMA layer (red)和4.2 nm污染层(green) on glass (blue)。 200 x 200光谱,7毫秒集成时间/频谱。总收购时间为5.4分钟。

图4.。 7.1nm PMMA层的颜色编码共聚焦拉曼图像(red)和4.2 nm污染层(green) on glass (blue)。 200 x 200光谱,7毫秒集成时间/频谱。总收购时间为5.4分钟。

图。图5示出了不同组件的光谱。为了更好地进行比较,它们以相同的最大强度显示。相对于玻璃光谱,PMMA光谱约为20次,污染光谱约15次。

根据图4中的拉曼测量计算的拉曼光谱,以相同的最大强度显示。比例仅对PMMA正确。相对于玻璃光谱,PMMA光谱约为20次,污染光谱约15次。

图5.。根据图4中的拉曼测量计算的拉曼光谱,以相同的最大强度显示。比例仅对PMMA正确。相对于玻璃光谱,PMMA光谱约为20次,污染光谱约15次。

从这一点,绿色谱(contamination)可以容易地鉴定为烷烃。在拉曼测量前几周为AFM厚度调查制备样品并储存在聚苯乙烯中(PS)容器。这些PS容器通过注塑制造,并使用烷烃来涂覆模具以便更好地分离。当样品被储存时(也许在温暖的环境中),部分烷烃蒸发并缩合在样品上,这解释了针状结构,并且涂层也覆盖了划痕的事实。

图5中的刻度为PMMA对PMMA的尺度是正确的,并且最多仅显示28个计数。通过完整的CH2拉伸方案平均信号(大约330 / cm或150像素)是1965年的计数。该测量的EM增益约为600×,因此1965年计数对应于仅99个电子(110 photons)每个CCD像素总数和1.4光子!但是如何使用这么少的电子获得良好的拉曼光谱?原因是平均约20,000个光谱以计算图5中所示的PMMA光谱,因此整体信号越大。

但是,只采用这些光谱,其中存在PMMA。为此,每光谱的信号必须足够强以显示在拉曼图像中PMMA的分布,因此可以选择对平均的正确光谱。可以看出,每个EMCCD像素的1.4光子足以在该示例中可视化PMMA层的分布,并为平均过程选择右谱。

如果已经使用了CH2拉伸制度中没有背景信号的基板,则结果将更令人印象深刻。图。图6显示了具有相同强度尺度的玻璃,烷烃和PMMA的三个光谱。

与图5中相同的光谱,但具有正确的尺度。

图6.。与图5中相同的光谱,但具有正确的尺度。

如人般认为,所用的玻璃基板具有小的拉曼峰,其在PMMA的一半信号中的约一半和烷烃信号的大约三分之一。显而易见的是,拉曼系统的诱人对于薄层的可检测性至关重要。即使使用最佳的共焦设置,信息深度也至少为500 nm,这意味着500nm的玻璃贡献到拉曼信号。随着拉曼信号与材料量成正比,标准(non-confocal)设置将收集玻璃信号300多倍以上(170 µM覆盖玻璃厚度),使得检测不可能的薄涂层,即使具有更长的整合时间。

概括

有人证明,使用EMCCD相机可以大大提高检测效率和速度,特别是对于共聚焦拉曼显微镜所需的短积分时间。 7.1nm PMMA以及4.2nm烷烃层的分布可以容易地检测并用每种光谱仅为7 ms的积分时间识别,这将总获取时间减少到200 x 200的5.4分钟(= 40,000)光谱共聚焦拉曼图像。

对于由CCD主导的非常小的信号'S读数噪声,与最佳可用标准CCD相比,使用EMCCD的使用可以将S / N比率提高5-10倍。'S,而对于较大的信号,电子乘以电路可以简单地关闭和标准的所有属性(back-illuminated) CCD are maintained.

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