新的光学显微镜超越了传统光学显微镜的分辨率

一种新的光学显微镜如此强大,它允许科学家们蔑视细胞内部,以辨别他们正在研究的几乎每个单独的蛋白质的精确位置,由霍华德休斯医学研究所的科学家展示并成功地证明'他的Janelia农场研究校园与国家卫生学院和佛罗里达州立大学研究人员合作。

新技术远远超过传统光学显微镜的分辨率,其固有地受光波长的限制。通过这些显微镜,不能彼此区分小于200纳米的物体。虽然研究人员可以通过在这种分辨率下学习细胞内蛋白质的布置来学习很多,但不足以确定单个蛋白质的位置–通常仅直径一到两个纳米。新方法称为光活化的定位显微镜(Palm),使科学家们更接近这个目标–区分分子仅为2至25纳米。

科学家刊登了2006年8月10日,版本的新技术的细节 科学表达 ,提前在线出版期刊 科学 .

2005年9月在一家发明者的起居室举办了新显微镜原型,Harald Hess,他将很快成为Janelia Farm的应用物理和仪表组的总监。 HESS与同事Eric Betzig的项目合作,他现在是Janelia Farm的一团领导者。显微镜上的大会和潜在的概念性工作均由Hess和Betzig每人支付25,000美元。

当Betzig和Hess开始发展这个概念时,这两个科学家失业了。两者都在考虑他们的职业生涯以及它们如何最大的影响科学世界。他们知道,在目前可用的分辨率大大优于图像的图像细胞需要新技术,并希望他们有能力解决这个问题的技能。

Hess和Betzig在如何建立更好的显微镜时都有很多想法。 1993年,Betzig在科学中发表了一篇论文,表明近场光学显微镜下的荧光分子的位置可以用精度识别远远大于光的波长曾经认为允许的光长。 1994年,在科学中发表的工作中,Hess和Betzig在一起表明,半导体中的紧密包装的光点可以单独隔离和研究。结合了这些早期的研究,Betzig后来提出,通过一次只成像几个分子并识别每个分子,可以在细胞中实现分子水平分辨率's center –但没有人知道如何分离一个细胞'S密集包装的蛋白质可以在生理条件下进行。

它是一个在生物实验室中开发的工具,最终激发了两个物理学家计划建立更好的显微镜。“在生物学世界中,新一代荧光蛋白质可以随着一点点紫罗兰光线接通,”HESS解释道。他和Betzig了解到这些分子,生物学家可以在2005年4月与佛罗里达州立大学(FSU)科学家迈克尔·戴维森的对话期间遗传地链接到他们希望学习的细胞蛋白质。

这两个人立即知道他们听到了关于光活化分子的听力完全适合他们以前的工作。在那个早期的工作中,Hess说,“我们开发了一种被称为光谱近场显微镜的东西,在那里我们将波长的光谱分布在大量的小闪光物中。这种技术使我们能够看到广义发光的各个组成部分。” In fact, that “generalized glow”很像科学家在使用光学显微镜时看到荧光标记的蛋白质中的荧光标记的蛋白质。

分子生物学技术允许研究人员将标签附加到他们希望学习的蛋白质的每份拷贝。常规光学显微镜可以检测这些分子,尽管HESS描述了它们在显微镜下的外观“小模糊圆球。” As Betzig'在九十年代早期的工作中所示,定位这些模糊球的中心可以将标记蛋白的位置识别到纳米级。但如果分子太靠近在一起–通常他们是–模糊边缘似乎重叠,显微镜不能区分它们。因此,标记分子的群集显示为不能分解成单个来源的合并发光。

但是,当Hess和Betzig了解到新的荧光标签,由George Patterson在NIH的Jennifer Lippincott-Schwartz实验室开发'国家儿童健康与人类发展研究所(Nichd),他们意识到他们可能是关键。他们的技术将使科学家能够将标记的蛋白质中标记的蛋白质的发光分成各个组件,类似于他们在以前的工作中所做的事情。可视化单独的分子可以像限制他们用于打开荧光探针的紫光度的量一样简单,因此它们只接受了标记分子的微小百分比。

这个概念击中了他们,因为他们涉嫌其他研究人员可能已经努力使它成为现实。“在我们想到的时候,‘这是如此简单,时间是如此成熟,'” recalled Betzig. “有这么多的实验室可以在一周内完成这一点,我们'重新开始。”但两人立即与他们所拥有的东西一起工作 –这已经成为旧光学设备的哈斯斯队从他们的钱包里的钱补充了贝尔实验室的日子。他们从设备上拂去了设备,在Hess的起居室设立了商店'S condominium在加利福尼亚拉霍亚。

在短短两个月,他们建立了仪器的原型。然而,他们还了解生物学和样品制备问题将像仪器一样大。因此,他们在尼科德的FSU和Lippincott-Schwartz和Patterson联系了Davidson。很快,所有三个团体都紧密合作,将概念带到现实。

到2005年10月,原型已准备好进行测试,部分归功于符合尼克地区保育的设备资源。 HHMI提供的额外财政资源确保该工作以来,由于Betzig几乎在同一时间,这项工作将在未来接受了Janelia Farm的团队领导者。

Betzig举例说明了Janelia Farm寻求的探险创造性科学家的类型,但由于校园仍在建设中,它还无法提供他和Hess所需的实验室空间和协作环境。因此,他们将原型移动到Lippincott-Schwartz的一个小空间'在NIH的实验室。虽然狭窄的宿舍和频繁的酒店住宿挑战,但赫斯和Betzig说,靠近他们的合作者–谁提供了他们缺乏的生物专业知识–当他们开发显微镜时非常宝贵。

他们的新技术背后的基本概念很简单:研究人员标记他们想要使用光活化探针研究的分子,然后将这些分子暴露于少量紫色光。光以小百分比分子激活荧光,并且显微镜捕获那些导通的图像直到它们漂白。该过程重复约10,000次,每次重复捕获不同分子子集的位置。

由于每个图像中捕获的分子数量很小,因此它们远远足够远,以单独地看到每个分子,从而使其中心局限地,Hess表示。当创建包含每个单独分子的中心的最终图像时,它具有先前仅通过电子显微镜实现的分辨率。然而,与电子显微镜不同,新技术允许在标记感兴趣的分子中进行更大的灵活性。

在2006年初,合作者正在考虑许多细胞结构的清晰图像,包括肌动蛋白长丝,局灶性粘附蛋白,线粒体和高尔基装置。“Performance-wise, it'只是令人惊讶。和简单的智慧's astounding,” Betzig said. “它从分辨率的角度敲击标准荧光显微镜的袜子。”

赫斯添加了,“此细节级别仅可用电子显微镜获得。然而,电子显微镜的对比度更加难以造成的,而我们可以将我们的对比限制为仅感兴趣的特定蛋白质。”

Lippincott-Schwartz指出,尽管成像技术都有优势,但是使用Palm在结合电子显微镜中特别强大。“Palm的一个很好的特征是可以容易地与电子显微镜一起使用,这产生了非常小的结构的详细图像– but not proteins – in cells,” she said. “通过将显示蛋白质分布的棕榈图像与显示相同样品的细胞结构的电子显微镜图像相关,可以了解分子在分子尺度以细胞结构中分别分布的方式。相关棕榈根据光和电子显微镜的优点,生产用于查看分子细节的革命性新方法。”

目前,Hess和Betzig专注于用单个荧光蛋白创建棕榈图像,这限制了每个样品的单一靶蛋白。“现在决议很棒,但它'■所有单一标签的东西。知道一个蛋白质所在的地方很好,” Betzig said, “但是你真正想知道的是多种蛋白质相互关系的地方。”研究人员现在正在探索使用额外的标记分子,最终使科学家能够获得蛋白质如何在细胞内彼此相互作用的分子水平视图。

这些是驱动蜂窝活动的相互作用,并在行动中观察它们对理解分子和细胞生物学之间的界面是重要的。“随着掌经技术的进步,它可能被证明是在其他方法无法达到的细胞内动态的分子级别秘密中解锁的关键因素,”观察到Davidson,在FSU指导光学显微镜师。

研究人员还承认,收集进入每个掌上图片的数千个单分子图像所需的时间是麻烦的。通过摄像机每秒捕捉一到两张照片,可以花两到12个小时才能拍摄单个样本。激活每帧的更多分子将减少必须收集的数量图像,并使分子更亮的将减少拍摄每个图像所需的时间。要么有助于加快掌手–当他们继续细化技术时,Hess和Betzig的高度优先考虑。

这两位发明人渴望继续将他们的技术发展成实际的生物学家使用的东西 - 当他们在未来几个月搬到Janelia Farm Campus时,他们预期的过程将更容易。“I think we'在去年来看,从两个失业的家伙来看,从两个失业的家伙里有一个想法,有一个很好的工作和一系列的数据,” Betzig noted. “现在,如果我们可以开始改进这种技术,我们应该真正能够将它带到大量的新应用程序。”

http://www.hhmi.org

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